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正文:

一、螢光抗體的原理

　　螢光抗體法 (Fluorescent Antibody Technique) 為應(yīng)用組織化學(xué)及免疫學(xué)的方法，在螢光色素物質(zhì)結(jié)合抗體的幫助下，使特異的抗原抗體複合物 (Antigen-Antibody Complex) 顯現(xiàn)在組織切片或細(xì)胞涂抹片，因此本法主要靠螢光色素及紫外光源。螢光色素是一種以紫外線激發(fā)照射而放出更長(zhǎng)波長(zhǎng)的物質(zhì)。當(dāng)一種物質(zhì)被激發(fā)而發(fā)光叫做螢光。如果能源被切斷仍繼續(xù)發(fā)光，叫做燐光 (Phosphorescence)。螢光物質(zhì)能標(biāo)附或結(jié)合于抗體球蛋白而不干擾其免疫學(xué)上的特異性及其結(jié)合抗體的能力。
　　 螢光抗體直接法可應(yīng)用于任何抗原的物質(zhì)，不管在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外、原蟲(chóng)、細(xì)菌、立克次氏體、病毒、組織抗原、激素或酵素。
　　另一種為螢光抗體間接法，是以未經(jīng)標(biāo)示之已知抗體和已知或未知抗原反應(yīng)。這個(gè)抗體叫做第一次抗體 (First Antibody)，第二步再以標(biāo)示之特異抗球蛋白抗體 (Second Antibody) 來(lái)染。如果有特異螢光出現(xiàn)，即可間接證明第一次抗體已與特異抗原結(jié)合。
　　還有一種為補(bǔ)體法，則以螢光標(biāo)示之抗補(bǔ)體抗體來(lái)染 " 抗原－抗體－補(bǔ)體複合物 "(Antigen-Antibody-Complement Complex)。
(一)  螢光抗體法的特性
(The Characteristics of Fluorescent Antibody Technique)
1.  特異性 (Specificity)
　　和螢光色素結(jié)合的抗體球蛋白是一種對(duì)抗原有很高特異反應(yīng)性的蛋白，因此，標(biāo)示抗體僅和特異相對(duì)抗原 ( 細(xì)菌、病毒、組織或細(xì)胞 ) 反應(yīng)，且亦可知道病毒在細(xì)胞之位置及包涵體 (Inclusion Body) 和病毒顆粒之關(guān)係。
2.  迅速性 (Rapidity)
　　染色步驟及螢光顯微鏡觀察能于 1～2 小時(shí)內(nèi)完成。故如豬假性狂犬病、豬瘟、狂犬病或其他已有標(biāo)示抗體者，當(dāng)病材送達(dá)后，1～2 小時(shí)即可知是否受到該病的感染存在。如果標(biāo)本內(nèi)可檢出抗原即可以肯定的做診斷，這比培養(yǎng)或動(dòng)物接種更節(jié)省時(shí)間。但是若為陰性，必須與其他診斷法併用來(lái)做最后診斷。
3.  敏感性 (Sensitivity)
　　螢光抗體之敏感性和 ELISA 法很相似，而高于中和反應(yīng)及血球凝集反應(yīng)試驗(yàn)。由于特異螢光的強(qiáng)度無(wú)法定量，故未能實(shí)際估計(jì)其敏感性。以間接法而言，僅第一次抗體 2 單位即能檢出抗原 ( 若抗原量足夠 )。此外本法之敏感性亦受抗原量之多寡影響。Coons(1956) 曾報(bào)告最少必須 0.8×l0-4μg/mm2 的肺炎球菌莢膜多醣體的濃度，才能以螢光抗體檢出。Pressman et al.(1958) 謂 5μ 的組織切片中，其能檢出之抗原濃度約為 1.4×l0-4μg/mm2。螢光抗體法之間接法及補(bǔ)體法之敏感性約比直接法高 5～10 倍。
(二)  必要條件 (Prerequisites)
1.  抗原 (Antigen)
　　材料的準(zhǔn)備必須儘量避免能和抗體反應(yīng)之抗原的損失。材料之前處理及固定必須能移去脂肪或其他干涉「抗原－抗體」反應(yīng)的物質(zhì)，且不影響抗原物質(zhì)固定于玻片。有時(shí)，固定作用會(huì)破壞抗原性與增強(qiáng)自發(fā)及非特異螢光，而未處理之材料因保持抗原性反而較易于觀察，因此染色必須有對(duì)照材料以資比較觀察。
2.  抗血清 (Antiserum)
　　非常強(qiáng)而特異的螢光抗體往往帶很弱之電荷�？寡�清之力價(jià)必須很高，須不含被檢組織之抗體或含量很低。抗血清中所含之對(duì)抗正常組織的抗體，必須由該組織或由丙酮乾燥製備之天竺鼠肝粉來(lái)處理吸收掉。若抗體之力價(jià)很高，則可稀釋抗體來(lái)降低所含之其他抗體的干擾。製備抗體之免疫動(dòng)物必需使用SPF動(dòng)物來(lái)增加抗體之特異性。標(biāo)示后的抗體必需經(jīng)過(guò) DEAE-Cellulose(0.14 M NaCl 在 0.0l M Phosphate buffer pH 7.3) 除去多帶 FITC 之抗體。
3.  標(biāo)示抗體 (Labelled Antibody)
　　本法中所使用之螢光色素物質(zhì)和抗體球蛋白很容易結(jié)合，其穩(wěn)定性高，不會(huì)影響抗體之結(jié)合反應(yīng)，具有相當(dāng)好的適量范圍 ( 螢光色素效率 )，且最高吸收及最低放出之波長(zhǎng)有很大不同。
4.  反應(yīng)的條件 (The Condition of Reaction)
　　螢光抗體之稀釋、作用溫度、緩沖鹽水之濃度、pH 值及水洗等都要小心控制，染色價(jià)必須事前由已知含量之抗原材料來(lái)測(cè)定，且染色液必須含 2～4 倍染色價(jià)。
5.  對(duì)照 (Control)
　　為確保染色反應(yīng)之特異性，必須有下列的對(duì)照：
(a)  抗原：(1) 正常未感染組織 (2) 含特異抗原之組織或 (3) 其他特異性抗原之組織。必須對(duì)照組之 (1) 及 (3) 都沒(méi)有螢光出現(xiàn)，而 (2) 卻有螢光出現(xiàn)。
(b)  抗體：在抑制試驗(yàn)中，以標(biāo)示異質(zhì)性抗體染色者應(yīng)為陰性。
6.  觀察 (Read)
　　螢光顯微鏡須有上面照光裝置 (Epi-Iliuminater)、暗視野聚光器 (Dark-Field Condenser)、Xenon Lamp 或高壓力之水銀燈，多種濾光器及照相裝置。紫外線的調(diào)整、濾光鏡及聚光器的選擇以及被檢材料暴露觀察時(shí)間等是否正確，都要注意，否則會(huì)影響判讀之結(jié)果。
(三)  螢光抗體法遇到之困雞
1.  自體螢光 (Autofluorescence)
　　組織或細(xì)胞產(chǎn)生之自然螢光 ( 即自體螢光 )，為白色或藍(lán)紫色，和特異螢光極易區(qū)別。較厚之組織切片易出現(xiàn)自體螢光。經(jīng)福馬林固定及石蠟包埋處理后亦易引起。
2.  外源特異螢光 (Extraneous Specific Fluorescence)
　　當(dāng)免疫原不純時(shí) ( 即有其他抗原污染，如蛋白質(zhì)、異質(zhì)性抗原或該動(dòng)物感染其他微生物 )，會(huì)發(fā)生此型之螢光。一般以正常組織粉末未能吸收之。例如：以自然感染 Sendai Virus 的小白鼠用于製造抗日本腦炎血清而以 FITC 結(jié)合，并應(yīng)用來(lái)測(cè)定病毒抗原之位置時(shí)，會(huì)造成未感染日本腦炎病毒之呼吸道細(xì)胞，卻有特異螢光出現(xiàn)之現(xiàn)象，故一般皆以 SPF 動(dòng)物製造特異抗體，或以單源抗體 (Monoclonal Antibody) 做特異抗體。
3.  非特異螢光 (Nonspecific Fluorescence)
　　非特異螢光可能來(lái)自未結(jié)合且未被除去之多馀標(biāo)示色素、抗體結(jié)合太多的色素、組織固定之不當(dāng)或材料染色過(guò)程中乾燥掉。小心控制球蛋白及 FlTC 之濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度、Gel Filtration 及 DEAE－cellulose 行 Column Chromatography (0.14 M NaCl in 0.0l M Phosphate Buffer，pH 7.3) 等條件，所得之染色結(jié)果非特異性最少，而其 Fluorcein / Protein Ration 為 ≦ 2.5 其算法如表一。以紫外線之吸收來(lái)計(jì)算 FITC Conjugates 之公式如下：
Con. of FITC－Protein(mg/ ml)＝OD 280－(0.36×OD 496)
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