基因載體轉(zhuǎn)殖 (Vector Transfection)

目的：將含特定基因的DNA載體送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，以表達(dá)特定蛋白質(zhì)。

原理：目前將DNA送入真核細(xì)胞有Calcium phosphate處理法、Polybrene處理法、DEAE-
dextran處理法、Electroporation處理法、Protoplast fusion法、Liposome處理法以及直
接將DNA注入細(xì)胞核內(nèi)的顯微注射法 (Direct microinjection into nuclei)。Liposome是
人工合成之胞膜，被研發(fā)當(dāng)作活體或離體試驗(yàn)的運(yùn)送載體。應(yīng)用原理是將DNA或
RNA包于Liposome中，由Liposome與細(xì)胞膜融合將DNA或RNA送入細(xì)胞內(nèi)。

儀器用具：二氧化碳水套式培養(yǎng)箱、倒立式螢光顯微鏡、無(wú)菌操作臺(tái)、四孔細(xì)胞培養(yǎng)皿、無(wú)
菌定量吸管。

藥品試劑：小鼠胚胎細(xì)胞株NIH/3T3、無(wú)血清無(wú)抗生素細(xì)胞培養(yǎng)液、完全培養(yǎng)液、含綠螢
光蛋白GFP (Green Fluorescence Protein)基因的DNA載體、轉(zhuǎn)殖試劑lipofectamine
2000。

步驟：
1. 將NIH/3T3以0.5 ml無(wú)抗生素細(xì)胞培養(yǎng)液, 0.5–2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔的密度植入四孔培養(yǎng)
皿中，培養(yǎng)24小時(shí)。
2. 對(duì)每一孔細(xì)胞轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)，以50 µl無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)液稀釋溷合0.8 µg欲轉(zhuǎn)殖的
DNA質(zhì)體。
3. 對(duì)每一孔細(xì)胞轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)，以50 µl無(wú)血清無(wú)抗生素細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋溷合2 µl轉(zhuǎn)殖試劑
lipofectamine 2000后，靜置于室溫下5分鐘。。
4. 將前述兩項(xiàng)DNA與轉(zhuǎn)殖試劑lipofectamine 2000稀釋液溷合靜置于室溫下20分鐘。
5. 對(duì)每一孔細(xì)胞轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)，將100 µl的前項(xiàng)DNA與lipofectamine 2000溷合液加入四孔
培養(yǎng)皿中的一孔。前后搖動(dòng)培養(yǎng)皿后，再放回二氧化碳水套式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6. 培養(yǎng)4–6小時(shí)，可吸出轉(zhuǎn)殖溷合液，換上新的完整細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培
養(yǎng)14–44小時(shí)，即可以倒立式螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白表達(dá)之情形。

四孔細(xì)胞培養(yǎng)皿

倒立式螢光顯微鏡

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